ハイブリッド型生物モーターのイオン選択透過分子機構の解明
研究の背景

近年，好アルカリ性 Bacillus属細菌から外環境に応答してH+とNa+の二種類の共役イオンを使い分ける新奇な“ハイブリッド型べん毛モーター”が発見された（Terahara et al, PNAS, 2008、 読売新聞などに記事が掲載）。イオンチャネルとして機能するべん毛固定子Mot複合体のイオン選択透過分子機構の詳細は未だ解明されていない。その解明は，モーターの動作原理の研究に資するだけでなく，イオン選択透過分子機構の研究，さらには環境適応進化の分野やナノテクノロジー分野へも貢献が期待できる波及効果の大きな研究課題である。伊藤研究室では、ハイブリッド型べん毛モーター固定子と単一のイオンのみを利用する固定子のイオン選択透過の違いから両タイプの固定子を分子生物学および構造解析手法により比較解析する方法でイオン選択透過分子機構を明らかにすることに取り組んでいる。さらに、大阪大学大学院理学研究科の今田勝巳教授と協力して，べん毛固定子複合体のX線結晶構造解析からのイオン選択透過分子機構を明らかにする研究に取り組んでいる。本研究では、イオン選択透過分子機構の解明を目指すとともに海洋性Vibrio属細菌のNa+駆動型べん毛モーター研究を主導している名古屋大学大学院理学研究科の本間道夫教授の研究室と連携して研究成果の情報を組み合わせることで，モーターの動作原理の理解を深化させることを目指している。

【図】H+駆動型MotA/MotB複合体とNa+駆動型MotP/MotS複合体の概略図
 

【図】ペプチドグリカン側から見た大腸菌MotA/MotB複合体(左)と枯草菌MotP/MotS複合体(右)の共役イオン流入ポケットの推定図

好アルカリ性細菌Bacillus alcalophilus由来の新奇ハイブリッド型生物モーターの発見

伊藤研究室では、2012年に動物排泄物から分離された好アルカリ性細菌 Bacillus alcalophilusが通常の好アルカリ性細菌が生育に利用するNa+よりもK+を利用することで高アルカリ性環境に適応していることを見出し、この菌のべん毛モーターがNa+以外にK+やRb+といったアルカリ・カチオンを共役イオンとして利用できる新奇なハイブリッド型モーターあることを発見した(Terahara et al, PLOS One, 2012、 日刊工業新聞、 科学新聞などに記事が掲載)。この成果は、べん毛モーターが共役イオンとしてK+やRb+を利用する最初の報告例となった。これまでの結果は、自然界には様々な環境が存在し、単細胞の微生物であっても生息する外環境に応じてべん毛モーターを適応進化させていることを示唆していた。このように、伊藤研究室は新奇なハイブリッド型べん毛モーターという分野を牽引する研究を進めている。

【写真】バチルス・アルカロフィラスは、pH10付近の高アルカリ性環境で活発に増殖する極限環境微生物です。中でもVedder1934株は、1934年にアメリカのVedderによってヒトの排せつ物から分離され報告された最初の好アルカリ性細菌です。
周べん毛性のべん毛モーターをもち、そのモーターは、Na+, Li+, K+, Rb+で駆動する特徴をもつハイブリッド型生体ナノマシンとして機能する。

細菌べん毛モーターのイオン選択透過分子機構の解明

 
Bacillus属べん毛モーター固定子のイオン選択透過とモーター機能に重要なアミノ酸残基の同定を行っている。これまでにBacillus属細菌が持つMotPS型とMotAB型固定子のモーター機能に重要なアミノ酸残基を特定した。この成果は、2014年に報告した（Takahashi & Ito, J. Biochem., 2014、Takahashi et al, J. Gen. Appl. Microbiol., 2014）。また、イオン選択透過に重要なアミノ酸残基としてB. alcalophilus 由来のNa+/K+/Rb+駆動型固定子のMotSサブユニットの膜貫通領域の33番目のメチオニン残基をロイシン残基に置換（MotS-M33L）するとNa+駆動型は保持しているがK+とRb+での駆動力を失うことを報告した（Terahara et al, PLOS ONE, 2012）。このようにBacillus属細菌の固定子は、MotSの膜貫通領域のアミノ酸残基が共役イオン選択透過に重要な役割を果たしていることが明らかとなってきた。今後、研究を更に進め、イオン選択にかかわるアミノ酸モチーフを明らかにすることで、他のイオン透過タンパク質のイオン選択フィルターとの関連性に収斂進化的な特徴などが見られるのか明らかにしていきたい。
 

好アルカリ性Bacillus属細菌の高アルカリ性環境適応機構の解明

共同研究先： マウントサイナイ医科大学 Terry Krulwich Lab.

研究背景

好アルカリ性細菌は多様な分布を示す極限環境微生物の一種であり、その中のいくつかはpH12以上の強アルカリ性環境でも生育することができる。好アルカリ性細菌は、バイオレメディエーションや産業応用に利用される酵素の生産菌としても注目されている。そして、最近では特に“好アルカリ性”とさらに別の極限環境でも生育するような微生物（例えば、好熱好アルカリ性細菌、好冷好アルカリ性細菌、好塩好アルカリ性細菌などのpolyextremophiles）からの有用酵素の分離例も報告されるようになった。近年、好アルカリ性細菌のゲノム解析が増え続けているおかげで、これらのゲノム情報から有用酵素の研究も進められている。さらに、タンパク質工学的手法を用いた耐アルカリ性酵素の改変技術も進歩している。
ところで、多くの好アルカリ性微生物の生育最適pHは10付近にある。これは、通常、よく研究されている好中性微生物とは明らかに異なる。そこで、好アルカリ性細菌の発見以来、なぜ過酷な環境を好んで生きているのか？という疑問があった。これまで報告されている好アルカリ性微生物の細胞内pHは、菌体外pHが8～11のときに8付近にある。従って、好アルカリ性微生物では、細胞表層を隔ててpH差が1.5以上あることになる。この細胞内の中性化には、細胞膜のNa+/H+アンチポーターなどが重要な役割を果たしている。

アルカリ環境適応におけるNa+/H+アンチポーターの役割

Na+/H+アンチポーターは，細胞内へのH+の再取込み経路の一つとして，また，細胞内へ流入するNa+の排出経路としても高アルカリ性環境適応に不可欠な膜内在性タンパク質として知られている。Na+/H+アンチポーターの交換輸送はプロトン駆動力に共役しており，大腸菌NhaAでは1Na+/2H+の交換比率で輸送が行われている。このように、より多くのH+を輸送することで高アルカリ性環境下においても膜電位依存的にNa+を能動輸送することができると考えられている。またNa+/H+アンチポーターはどの生物種においても普遍的に存在するタンパク質であり、細胞内ホメオスタシスにとって重要な役割を担っている。特に好アルカリ性Bacillus属細菌においては、Mrp (マープ；Multiple Resistance and pH adaptation)と呼ばれるNa+/H+アンチポーターが高アルカリ性環境適応において中心的な役割を担っている。
Mrpは，好アルカリ性細菌Bacillus halodurans C-125株のアルカリ感受性変異株を相補する変異箇所として発見された。一般的にNa+/H+アンチポーターの多くは一遺伝子から発現され、単量体もしくはホモ二量体として機能しているものが多い。しかし、Mrpはオペロン構造をとる7つの遺伝子から発現され、そのNa+/H+アンチポート活性には、すべての遺伝子産物を必要とする。発現されるタンパク質はすべて疎水性タンパク質であり、それら遺伝子産物は膜タンパク質複合体を形成している。Mrpは、好アルカリ性細菌に特異的というわけではなく広く真正細菌や古細菌にその相同タンパク質が存在する。それらホモログのmrp遺伝子クラスターの構造は多様性に富んでいる（図）。例えば、Bacillus属細菌由来のmrp遺伝子クラスターなどは7つの遺伝子からなる。一方でコレラ菌などのmrp遺伝子クラスターは、mrpAとmrpBが融合して一つの遺伝子として存在しているため、6つの遺伝子から構成されている。また、シアノバクテリアのMrpは、mrpCとmrpD遺伝子を2つずつ保持する特徴的な遺伝子クラスターから発現される。このように遺伝子構造が多岐にわたるMrpホモログも、基本的にはNa+/H+アンチポーターもしくはK+/H+アンチポーターとして機能し、それぞれの宿主細胞で高アルカリ性環境や高塩性環境への適応に主要な役割を果たしている。近年、イエローストーン国立公園の熱水噴出孔から分離されたThermomicrobium roseum由来のMrpホモログは、Ca2+/H+アンチポーター活性を示した。Mrpにおいても微生物自身の生育環境に適応した共役イオンへと進化が見られることは大変に興味深い。

好アルカリ性Bacillus属細菌における酸化的リン酸化の特徴

　細胞内で消費される大半のATPの合成は、呼吸鎖により形成されるプロトン駆動力を利用してATP合成酵素が行う。通常，このような細胞膜上で行われる一連の酸化的リン酸化は、プロトン駆動力に共役して行われるが、嫌気性好アルカリ性細菌のようにナトリウム駆動力を利用してATP合成を行う例も発見されている。一方で、B. pseudofirmus OF4株やB. halodurans C-125株のような好気性好アルカリ性Bacillus属細菌は、べん毛の回転や栄養の取り込みにナトリウム駆動力を利用しているが、酸化的リン酸化によるATP合成にはプロトン駆動力を利用している。高アルカリ性環境は、プロトン駆動力を利用しづらいので好アルカリ性Bacillus属細菌はこのような環境において効率よくATP合成を行う機構を兼ね備えていると考えられている。
好気性好アルカリ性Bacillus属細菌のFoF1-ATP合成酵素やプロトンポンプとして機能する呼吸鎖複合体のcaa3型シトクロム酸化酵素のサブユニットは、アミノ酸配列のマルチアライメント解析により好アルカリ性細菌特有のモチーフを持つことが明らかとなっている。OF4株のFoF1-ATP合成酵素において、この好アルカリ性細菌に特有のモチーフに好中性細菌のものと同じアミノ酸置換変異を導入することで、高アルカリ性環境での生育低下やATP合成能の低下が引き起こされることが報告されている。また中性環境よりも高アルカリ性環境で生育させた好アルカリ性Bacillus属細菌の細胞膜には電子伝達系の成分であるシトクロムが通常の数倍存在する。また，pH10.5で培養したOF4株では，caa3型シトクロム酸化酵素がFoF1-ATP合成酵素よりも4倍量も過剰に発現している。反対にpH7.5で培養したOF4株では，1.6倍しか発現量に差がない。このことから、電子伝達によって排出されるH+は，細胞外液と平衡にならず，細胞膜内で直接FoF1-ATP合成酵素に渡して利用されればATP合成は可能と考えられている。マウントサイナイ医科大学のKrulwich教授らによりこの細胞膜内を介した局所的H+の循環によるエネルギー共役説（図）が提唱されているが、いまだに証明はされていない。現在までに、飽和移動電子スピン共鳴法や示差走査熱量測定法といった手法を用いて試験官内でcaa3型シトクロム酸化酵素とFoF1-ATP合成酵素が共局在していることが報告されている。しかし，実際の細胞内での共局在に関する直接的な証拠は得られていない。ミトコンドリア呼吸鎖では，呼吸鎖複合体やFoF1-ATP合成酵素が超複合体を形成して効率的なプロトン駆動力の利用を図っていることが示唆されている。好アルカリ性細菌においても小さなプロトン駆動力しか得られない高アルカリ性環境でエネルギー共役に関わる膜タンパク質間の距離を近接させることで、呼吸鎖から排出されたプロトンが外環境の水酸化物イオンとの中和に利用されるのではなく、直接的にATP合成酵素にプロトンを受け渡すことによって、より効率的にATP合成を行っている可能性が示唆される。今後、この問題の解明が待たれる．

【図】 エネルギー共役説の概略図　シトクロムcaa3とFoF1-ATP合成酵素のタンパク質間相互作用によるプロトンの受け渡しの様子